植物DNAOUT(植物DNA提取试剂盒)的应用！

一、背景

植物DNAOUT(植物DNA提取试剂盒)适用于植物叶片、种子的基因组DNA提取，可配合全自动核酸提取仪进行高通量、自动化操作。

植物DNAOUT(植物DNA提取试剂盒)适用于从植物组织和植物干粉中提取总DNA，包括基因组DNA，线粒体DNA以及叶绿体DNA。本品可以处理多至100 mg的样本，可纯化获得大为50 kb的DNA，多数片段在20-30 kb之间。本试剂盒采用先进的硅胶膜技术和简单的离心程序，无需乙醇沉淀，简单快速地分离得到高纯度的DNA，有效去除PCR和其他酶促反应的抑制剂。本品可以在1小时内完成总DNA的提取，纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

二、操作步骤

1、取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约20 mg，加入液氮充分研磨。

2、将研磨后的粉末收集到离心管(自备)中，加入700μl 65℃预热的Buffer GP1(使用前在预热的Buffer GP1中加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1%)，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。

3、加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm(～～13400?g)离心5分钟。

4、小心将上层水相转入一新的离心管(自备)中，加入700μl Buffer GP2，充分混匀。

5、将步骤4中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7.

8、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-100μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

三、应用

用于基于叶绿体基因序列的兰科植物DNA条形码探讨研究：

以6个叶绿体基因（matK、rbcL、ndhF、rpoB、rpoC1、ycf1）基于DNA条形码技术为兰科植物的物种鉴别、种质资源的保护和创新利用提供理论依据。

主要研究结果如下：

1、分析了所研究序列的GC含量、变异位点数。其中单基因中,matK、ndhF、ycf1提供了相对较高的变异位点,在兰科植物中有相对较快的进化速率;组合序列中,matK ycf1、rbcL ndhF、rpoC1 ycf1提供了相对较高的变异位点。

2、开展了遗传多样性指数计算及核苷酸配对差异分布评估。较高的单倍型多样性及相对较低的核苷酸多样性表明单个及组合基因在兰科植物的种群中存在一定的多态性差异,而多个峰值的核苷酸差异分布显示没有出现群体扩张。

3、通过6个单基因序列及15个组合序列的核苷酸替换饱和度分析,发现这些序列均为达到饱和状态适合于系统发育关系的分析。系统发育关系及基于遗传距离分析的结果表明:单个基因中,ndhF、ycf1基因在兰科植物属、种水平上鉴别比较理想;组合序列中,matK ycf1、ndhF ycf1在属、种水平上有较理想的鉴别能力,推荐ndhF、ycf1、matK ycf1、ndhF ycf1作为兰科植物的候选条形码。

4、基于SNP位点利用候选基因获取兰科植物物种特异性条形码,并生成可以迅速被电子设备识别的DNA二维码身份证。通过开展此研究,可以为兰科植物高效的物种鉴定提供重要的基础数据和研究方法,也可为研究者提供标准化、准确性高的兰科植物物种条形码的信息。